乳腺癌的放疗效果受放疗耐药性的限制，如放射耐药会导致复发并使乳腺癌难治，然而，辐射耐药背后的机制尚不完全清楚。癌细胞的辐射反应很复杂散户配资，主要由其内在的修复能力决定，而修复能力是在基因水平上控制的。
山东大学在《Cell death & disease》期刊发布题为"RUVBL1 ubiquitination by DTL promotes RUVBL1/2-β-catenin-mediated transcriptional regulation of NHEJ pathway and enhances radiation resistance in breast cancer"的文章，通过蛋白质组学、转录组学及相关蛋白泛素化、乙酰化水平变化的验证等实验揭示了DTL的RUVBL1泛素化促RUVBL1/2-β-catenin 介导的 NHEJ 通路转录调节并增强乳腺癌的辐射抗性。
研究背景
乳腺癌是女性最常见的癌症类型，也是全球女性癌症相关死亡的第二大原因。放疗仍然是乳腺癌手术后的主要治疗方法，它不仅可以改善原发癌的生长，还可以降低复发和远处转移的风险。然而，很大一部分乳腺癌患者在放疗后 10 年内继续复发，并且患者对放疗产生耐药性，导致总生存期差。因此，探索导致乳腺癌耐辐射的潜在机制至关重要，这将有助于避免放疗耐药并提高乳腺癌患者的生存率。
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实验材料：7只3 Gy放射治疗乳腺癌小鼠（放疗组）、未治疗7只乳腺癌小鼠（对照组）；
实验方法：蛋白质组学、IP/MS、WB、转录组等
主要结果
RUVBL1 在乳腺癌放疗中起重要作用
为研究乳腺癌的放射耐药机制，作者通过MMTV-PyMT构建小鼠乳腺癌放疗模型，当乳腺癌肿瘤生长到200 mm3时，随机盲分为对照组和放疗组，每组 7 只小鼠，放疗组接受 5 次 3 Gy 放疗（每 2 天一次），最后一次照射后 4 小时，采集小鼠肿瘤。结果显示相对于对照组，照射肿瘤的生长受到显着控制。
为探讨放疗后乳腺癌蛋白质组学的差异，作者收集了小鼠乳腺癌组织进行质谱分析。经过质谱分析，共鉴定出 2130 种蛋白质，其中 148 种蛋白质在放射治疗组中显著增加，而 200 种蛋白质在放射治疗组中显著减少，对这些差异表达蛋白的进一步功能富集分析表明，这些蛋白主要参与生物过程，如蛋白质转移、细胞间粘附、DNA 修复、碳水化合物代谢和泛素化依赖性蛋白质降解。由于 DNA 修复与肿瘤辐射抗性密切相关，因此作者首先关注DNA修复过程中的这些差异表达蛋白。在这些与 DNA 修复相关的差异蛋白中，发现 RUVBL1 在接受放射治疗的不同肿瘤组织中始终保持高表达水平，通过实验也验证了RUVBL1在接受放射治疗的不同肿瘤组织中相对于其他的蛋白始终保持高表达水平和显著差异性，因此作者选择 RUVBL1 进行进一步研究。这些结果表明，放射治疗诱导 RUVBL1 的表达，也表明 RUVBL1 可能在乳腺癌放射耐药中发挥调节作用。
图 RUVBL1 在放射乳腺肿瘤组织中的表达相对较高
研究表明，图 RUVBL1 在放射乳腺肿瘤组织中的表达相对较高RUVBL1 调节肿瘤耐药性，并参与调节 DNA 损伤中的 HR 修复途径，但其在乳腺癌放射耐药性中的功能知之甚少。为了进一步阐明 RUVBL1 在乳腺癌辐射耐药性中的作用，作者构建了在乳腺癌细胞中稳定过表达或敲低 RUVBL1 的细胞系（MAD-MB-231、MCF7 和 BT549），随后以不同剂量照射这些细胞系，结果表明 RUVBL1 的过表达显着增加了细胞活力和增殖。相反，敲低 RUVBL1 会显著降低细胞活力和增殖。此外，作者还检测到放射治疗后过表达 RUVBL1 的乳腺癌细胞的 DNA 损伤水平，结果表明，过表达 RUVBL1 显著降低了乳腺癌细胞中 γ-H2AX 蛋白的表达水平。最后，将过表达 RUVBL1 的乳腺癌细胞接种到裸鼠体内，并在肿瘤生长 12 天后连续照射，结果表明，RUVBL1 的过表达显着增加了肿瘤生长和重量。这些结果表明，RUVBL1 调节乳腺癌细胞对放射治疗的耐药性。
图 RUVBL1 调节乳腺癌细胞的辐射抗性
DTL 通过泛素 K63 泛素化 RUVBL1
为进一步阐明 RUVBL1 促进乳腺癌细胞对放射治疗的耐药性机制，作者使用 CoIP-MS来寻找 RUVBL1 可能结合的蛋白质。质谱和免疫共沉淀证实 RUVBL1 可以与 DTL 结合，作者以往的研究表明 DTL 通过影响 DNA-PKcs 蛋白的稳定性来调节正常细胞中 DNA 损伤的积累。因此作者推测 DTL 可能参与 RUVBL1 对乳腺癌细胞辐射抗性的调节。研究表明，DTL 作为 CUL4A E3 泛素偶联酶的底物识别受体，通过特异性结合靶蛋白的泛素化修饰来影响靶蛋白的稳定性和功能 ，因此作者检测了RUVBL1 的泛素化水平，结果显示 DTL 泛素化了HEK293T 细胞中的 RUVBL1，同时作者还在乳腺癌细胞、MDA-MB-231细胞中验证了结果，结果均表明：RUVBL1 与 DTL 结合，DTL 促进 RUVBL1 泛素化，随后的蛋白质半衰期结果表明，DTL 的过表达不会影响 RUVBL1 蛋白的稳定性，）。这些结果表明，RUVBL1 的 DTL 泛素化可能是泛素 （Ub） K63 位点的单位修饰。进一步的泛素化实验结果表明，DTL 对 RUVBL1 的泛素化修饰为 Ub K63 模式。这些结果表明，DTL 可能影响 RUVBL1 的功能，从而调节乳腺癌细胞的辐射抵抗力。
作者在放疗后的MDA-MB-231-RR 细胞检查了DTL 对RUVBL1 泛素化的影响，发现 DTL 促进了 RUVBL1 泛素化。此外，作者分析了 RUVBL1 与在不同位点突变的泛素之间的相互作用，在MDA-MB-231-RR细胞中进行了免疫沉淀实验，以验证 RUVBL1 与泛素 K63 之间的相互作用，发现当仅存在K63位点时，这些蛋白质之间存在强大的结合。这与MDA-MB-231 细胞的结果一致。结果表明，DTL 在 RUVBL1的 K63 位点泛素化 在乳腺癌细胞的辐射耐受性中起关键作用。
图 RUVBL1 可增强 DNA 损伤修复，并被 DTL 泛素化
RUVBL1 以 DTL 依赖性方式调节乳腺癌放射抗性
考虑到 RUVBL1 在乳腺癌细胞中被 DTL 泛素化，作者假设 DTL 可能在乳腺癌中发挥放射抗性作用。为了验证这一假设，作者构建了在乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF7 和 BT549）中过表达或敲低 DTL ，随后用不同的辐射剂量照射这些乳腺癌细胞，结果表明，DTL 的过表达显着增加了细胞活力和增殖，而敲低 DTL 显著降低了细胞活力和增殖。最后，将过表达 DTL 的乳腺癌细胞接种到裸鼠体内，并在肿瘤生长 12 天后连续照射，结果显示，DTL 的过表达显著增加了肿瘤生长和重量。这些结果表明，DTL 还具有调节乳腺癌放射抗性的功能，类似于 RUVBL1 的功能。
为了进一步了解 RUVBL1 和 DTL 在乳腺癌放射耐药性调节中的作用，作者在MDA-MB-231 细胞中过表达RUVBL1 、敲除了DTL，随后对这些细胞进行不同剂量的辐射照射，结果显示DTL 的敲除明显逆转了 RUVBL1 对增强乳腺癌细胞抗辐射性的影响。体内肿瘤RUVBL1 过表达和 DTL 敲除细胞的放射治疗也显示出类似的结果。这些结果表明 DTL 参与 RUVBL1 介导的乳腺癌辐射耐药性。
此外作者检测了 MDA-MB-231-RR 细胞系 DTL 敲低后辐射抗性的变化，发现 MDA-MB-231-RR 细胞的辐射敏感性增加，同时还发现DTL的敲除可以影响RUVBL1的泛素化水平。这表明DTL-RUVBL1在 MDA-MB-231-RR 耐辐射性中起重要作用。
图 DTL 调节乳腺癌细胞的辐射抗性
图 RUVBL1 通过 DTL 调节乳腺癌细胞的辐射抗性
DTL 泛素化 RUVBL1 以减弱 H4K16 乙酰化
以往研究表明，甲基化的 RUVBL1 与 TIP60 结合以乙酰化 H4K16，从而促进 DNA 双链断裂的 HR 修复过程，但作者的WB实验表明，过表达 RUVBL1 可显着促进 H4K16ac 的水平，但过表达 DTL 显着降低了 RUVBL1 对 H4K16 的乙酰化修饰，DTL 敲除显著促进了 RUVBL1 对 H4K16 的乙酰化。随后的IP实验发现DTL 显着促进 RUVBL1 和 RUVBL2 间的相互作用，并抑制 RUVBL1 和 TIP60 之间的相互作用。在 MDA-MB-231-RR 细胞中通过WB实验显示，当当 DTL 水平较低时，RUVBL1 与 RUVBL2 的结合降低。然而，RUVBL1 和 TIP60 的组合增加。这些结果表明，6G）。DTL 通过泛素化修饰 RUVBL1 增加了其与 RUVBL2 的相互作用，但抑制了 RUVBL1/2 与 TIP60 的相互作用，且DTL-RUVBL1 不通过 TIP60-H4K16ac 促进 HR 通路。
图 DTL-泛素化-RUVBL1 减弱 H4K16 乙酰化介导的 HR 修复途径
DTL 对 RUVBL1 的泛素化促进 RUVBL1/2-β-catenin 复合物的形成
为了进一步探讨 DTL 对 RUVBL1 的泛素化如何调节乳腺癌细胞的辐射抗性，我们对稳定过表达 RUVBL1 的辐射照射乳腺癌细胞进行了转录组学分析（RNA-seq）。发现与对照细胞相比，RUVBL1过表达细胞中547个基因的表达发生了显著的变化（FC≥ 2,P < 0.05），差异表达基因的功能富集分析显示，β-catenin复合物组装、双链断裂的非同源末端修复（NHEJ）和 Jak-STAT 信号通路被富集，并且这些信号通路与细胞辐射抗性相关，随后，通过分析文献中与辐射和 DNA 损伤相关的转录因子和辅助因子，发现了 β-catenin 、 c-Myc 和 STAT3。这些转录相关因子与辐射抗性有关，也与 RUVBL1 有关，这三个因素也反映在了作者的 RNA-Seq 中，进一步的免疫共沉淀结果表明，RUVBL1可以分别与β-catenin、c-Myc 和 STAT3 相互作用。然而，DTL 的过表达仅显着增加了 RUVBL1 与 β-catenin 的相互作用，随后的泛素化实验进一步证实，DTL 的 K63 泛素化修饰的 RUVBL1 增加了与 β-catenin 的相互作用。这也在 MDA-MB-231-RR细胞中得到了验证。当Ub-K63存在时，RUVBL1与 RUVBL2 和β-catenin强烈结合。这些结果表明DTL-泛素化-RUVBL1 促进 RUVBL1 与 β-catenin 的相互作用。
图 DTL 促进 RUVBL1 与转录辅因子 β-catenin 的结合
DTL 对 RUVBL1 的泛素化通过 β-catenin 介导的转录调控促进 NHEJ 修复分子的表达
作者之前的实验结果表明， DTL-泛素化-RUVBL1 减弱了 H4K16 乙酰化介导的 HR 修复途径，RNA-seq 分析表明 RUVBL1 调节 NHEJ 修复途径。因此，作者推测 DTL-RUVBL1 可能通过调节 NHEJ 修复来增强乳腺癌细胞的辐射抵抗力。随后发现，RUVBL1/DTL 的过表达大大增加了乳腺癌细胞内NHEJ修复途径分子的表达，即K70、K80、DNA-PKcs、53BP1、LIG4 和 XRCC4。报告基因的结果表明，NHEJ修复途径的激活是由RUVBL1启动的，RUVBL1/DTL 的过表达显著降低了 HR 修复相关分子的表达。与正常乳腺癌细胞相比，耐放射细胞显示 NHEJ 通路蛋白的表达增加，而 HR 通路蛋白的变化不显著。这一发现与RUVBL1/DTL 的高表达一致，表明辐射暴露后 NHEJ 通路激活。DTL 敲除显著逆转了 RUVBL1 增加的 NHEJ 修复分子表达，而 HR 修复分子的作用则相反。这些结果表明，RUVBL1-DTL 通过增强乳腺癌细胞中的 NHEJ 修复途径来增加乳腺癌细胞的辐射抵抗力。
因发现 DTL 泛素化促进了 RUVBL1/2 和 β-catenin 之间的相互作用，因此作者试图验证 β-catenin 是否介导 RUVBL1/DTL 对 NHEJ 修复途径分子表达的调节。在过表达RUVBL1 和 DTL 的乳腺癌细胞中敲除 β-catenin 可显著降低 NHEJ 分子的表达水平。此外，作者观察到当 DTL 表达高时，NHEJ 修复效果增加，而 β-Catenin 敲除降低了 RUVBL1 和 DTL 的 NHEJ 修复益处。这一发现支持我们的结论，即 DTL-RUVBL1-β-catenin 通过促进 NHEJ 修复途径增强乳腺癌的辐射耐受性。敲除 β-catenin 可显著降低 RUVBL1-DTL 介导的乳腺癌体外和体内辐射耐药性。这些结果表明，DTL-泛素化-RUVBL1通过β-catenin 转录调节 NHEJ 修复分子的表达，从而增强乳腺癌细胞的抗辐射性。
图 RUVBL1 影响 NHEJ 通路基因的表达，受 DTL 调控
图 DTL-RUVBL1-β-catenin 调节乳腺癌细胞的辐射抗性
研究结论
总而言之，在该项目研究中，作者利用蛋白质组学、WB、COIP-MS、转录组学等方法表明了RUVBL1 的 DTL 泛素化促进 RUVBL1/2-β-catenin 复合物的形成，从而调节 NHEJ 修复通路分子的转录并增强乳腺癌细胞对放射治疗的抵抗力。通过对 DTL-RUVBL1/2-β-catenin 在乳腺癌辐射耐药机制中的研究，有望系统揭示乳腺癌细胞的耐辐射机制，也为乳腺癌耐辐射的治疗提供新思路。
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